液相色谱操作过程常被忽略的故障问题

发布日期：2023-07-07 作者：点击：

　　液相色谱操作过程常被忽略的故障问题
　　01【流动相未过滤】
　　因为灰尘或任何其他杂质颗粒会磨损柱塞、密封圈、圆筒和止回阀，所以流动相中的任何固体颗粒都应预先除去。流动相Z好在玻璃容器中蒸馏，常用的方法是过滤。可以使用微孔滤膜(0.2μm或0.45μm)等过滤器。泵的入口应连接一根滤砂器棒(或片)。输液泵的过滤器应经常清洗或更换。
　　02【泵使用后未及时清洗】
　　流动相不应含有任何腐蚀性物质，含有缓冲液的流动相不应留在泵中，尤其是如果泵停止过夜或更长时间。如果含有缓冲溶液的流动相留在泵中，由于蒸发或泄漏，甚至仅仅是因为溶液静置，盐的细晶体可能沉淀，这将损坏密封圈和柱塞以及上述固体颗粒。因此，需要泵入纯水对泵进行充分清洗，然后更换为适合色谱柱保存和泵维护的溶剂(反相键合硅胶固定相为甲醇或甲醇-水)。
　　03【流动相清空】
　　泵工作时，要注意防止溶剂瓶中的流动相被用完，否则空泵运转也会磨损柱塞、缸体或密封圈，Z终产生泄漏。
　　没有流动相流出，没有压力指示怎么办？
　　泵里可能有很多气体。此时可以打开泄压阀，使泵以大流量(如5ml/min)运行，将气泡排出。一个50毫升的注射器也可以用来帮助泵出口的气体。另一个可能的原因是密封圈磨损，需要更换。
　　04【压力和流量不稳定】
　　原因可能是泡沫，需要消除；或者单向阀内有异物，可将单向阀取出，浸入丙酮中进行超声波清洗。有时滤砂杆中可能有气泡，也可能被细小的盐粒或微生物部分堵塞。此时可将砂滤棒取出，浸入流动相中进行超声除泡，也可将砂滤棒浸入稀酸(如4mol/L硝酸)中快速去除微生物，也可将盐溶解后立即清洗。

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　　为什么压力过高或过低？
　　可能是管道堵塞了，需要清洗清理。压力下降的原因可能是管道泄漏。逐段检查堵塞或泄漏情况。
　　进行梯度洗脱时，多种溶剂混合，成分不断变化，带来一些特殊问题，须引起充分重视。
　　PS:梯度洗脱法用于液相色谱中成分复杂的样品。在同一分析周期内，流动相的浓度比按照一定的程序不断变化，称为梯度洗脱。因此，一个复杂样品中不同性质的组分，按照各自合适的容量因子k，可以达到很好的分离目的。
　　梯度洗脱的优点是:1。缩短分析周期；2.提高分离能力；3.峰形得到改善，几乎没有拖尾；4.增加灵敏度。但有时会导致基线漂移。
　　05【梯度洗脱流动相选择不当】
　　要注意溶剂的互溶性，不互溶的溶剂不能作为流动相进行梯度洗脱。有些溶剂在一定比例下是互溶的，但超出范围后就不互溶了，使用时要注意。当有机溶剂和缓冲剂混合时，盐晶体也可能沉淀，尤其是当使用磷酸盐时。
　　06【忽略空白梯度洗脱】
　　梯度洗脱中使用的溶剂纯度较高，以确保良好的重现性。样品分析前须进行空白梯度洗脱，以识别溶剂的杂质峰，因为弱溶剂中的杂质在色谱柱头部富集后会被强溶剂洗脱。用于梯度洗脱的溶剂需要完全脱气，以防止在混合过程中形成气泡。
　　07【溶剂混合引起的粘度变化】
　　混合溶剂的粘度往往随组成而变化，因此梯度洗脱时压力往往会发生变化。比如甲醇和水的粘度小，当两者以相近的比例混合时，粘度增加很多。此时，柱压约为流动相甲醇或水的两倍。因此，应注意防止梯度洗脱时的压力超过输液泵或色谱柱所能承受的Z大压力。
　　08【六通阀的正确使用和维护】
　　(1)进样前须用0.45μm滤膜过滤样品溶液，以减少颗粒对进样阀的磨损。
　　(2)旋转阀芯时，不能太慢，更不能停留在中间位置，否则会堵塞流相，使泵内压力急剧升高，甚至超过泵的Z大压力；再次前往注射位置时，过高的压力会损坏柱头。
　　③为防止缓冲盐和样品残留在进样阀中，每次分析后都应冲洗进样阀。通常可以用水洗，也可以先用能溶解样品的溶剂洗，再用水洗。
　　09【色谱柱的使用和维护】
　　色谱柱的正确使用和维护非常重要。稍有不慎就会降低色谱柱效率，缩短使用寿命，甚至损坏色谱柱。在色谱操作过程中，为了维护色谱柱，需要注意以下问题。
　　10【调节流速过快】
　　避免压力和温度的急剧变化以及任何机械振动。温度的突然变化或色谱柱从高处坠落会影响柱内的填充情况；柱压突然升高或降低也会对柱内填料产生冲击，所以流速要慢慢调节，进样时阀门的旋转不能太慢(如上所述)。
　　11[反冲柱]
　　一般来说，色谱柱是不能反洗的，只有在生产商表示可以反洗的情况下，才可以通过反洗将残留在柱头上的杂质去除。否则反洗会迅速降低柱效。
　　12【预制柱和保护柱】
　　选择合适的流动相(尤其是pH值)以避免固定相的破坏。有时预柱可以连接在取样器的前面。当分析柱为键合硅胶时，预柱为硅胶，这样流动相在进入分析柱前可以被硅胶提前“饱和”，可以防止分析柱中的硅胶基质被溶解。
　　为了避免将具有复杂基质的样品，尤其是生物样品直接注入色谱柱，需要对样品进行预处理，或者在进样器和色谱柱之间连接保护柱。保护柱通常是填充类似固定相的短柱。保护柱可以而且应该经常更换。